Allt om begränsningsenzymer

Hur mycket vet du om restriktionsenzymer? Få en bättre förståelse för vad de gör och varför de är viktiga, med den här översynen.

Definiera restriktionsenzymer

Restriktionsendonukleaser är en klass av enzym som skär DNA-molekyler. Varje enzym känner igen en unik sekvens av nukleotider i DNA-strängen. Sådana sekvenser är vanligen ca 4 till 6 baspar lång. Sekvenserna är palindroma genom att den kostnadsfria DNA-strängen endast har samma sekvens i omvänd riktning.

Med andra ord skärs båda DNA-strängarna på samma plats.

Där dessa enzymer hittas

Restriktionsenzymer finns i många olika bakteriestammar, där deras biologiska roll är att delta i cellförsvar. Dessa enzymer "begränsar" främmande (t.ex. virus) DNA som kommer in i cellen genom att förstöra det. Värdcellen har ett restriktionsmodifieringssystem som metylerar sitt eget DNA vid specifika ställen för sina respektive restriktionsenzymer, varigenom det skyddas från klyvning. Mer än 800 kända enzymer har upptäckts som känner igen mer än 100 olika nukleotidsekvenser.

Användning i bioteknik

Begränsningsenzymer används i bioteknik för att skära DNA i mindre strängar för att studera skillnader mellan fragmentlängder bland individer (Restriktionsfragmentlängdspolymofism - RFLP). De används också för genkloning.

RFLP-tekniker har använts för att bestämma att individer eller grupper av individer har särskiljande skillnader i gensekvenser och restriktionsspaltningsmönster i vissa områden av genomet.

Kunskapen om dessa unika områden är grunden för DNA-fingeravtryck. Var och en av dessa metoder beror på användningen av agarosgelelektrofores för separation av DNA-fragmenten. TBE-buffert, som består av Tris-bas, borsyra och EDTA, används vanligen för agarosgelelektrofores för att undersöka DNA-produkter.

Typer av restriktionsenzymer

Det finns tre olika typer av restriktionsenzymer. Typ I skär DNA på slumpmässiga platser så långt som 1000 eller flera baspar från igenkänningssidan. Typ III-skär vid ungefär 25 baspar från platsen. Typerna I och III kräver ATP och kan vara stora enzymer med flera underenheter. Typ II-enzymer, som övervägande används i bioteknik, skär DNA i den igenkända sekvensen utan behov av ATP och är mindre och enklare.

Typ II-restriktionsenzymer heter enligt bakteriearterna från vilka de isoleras. Exempelvis isolerades enzymet EcoRI från E. coli . Det mesta av allmänheten är bekant med E. coli utbrott i mat.

Typ II-restriktionsenzymer kan generera två olika typer av skär, beroende på huruvida de skär båda strängarna i mitten av igenkänningssekvensen eller varje sträng närmare den ena änden av igenkänningssekvensen.

Den tidigare skärningen kommer att generera "trubbiga ändar" utan några nukleotidöverhang. Den senare genererar "klibbiga" eller "sammanhängande" ändar eftersom varje resulterande fragment av DNA har ett överhäng som komplimangerar de andra fragmenten. Båda är användbara i molekylär genetik för att göra rekombinant DNA och proteiner.

Denna form av DNA sticker ut eftersom den produceras genom ligering (sammanbindning) av två eller flera olika strängar som inte ursprungligen var länkade ihop.