Tekniker för sekvensering DNA

Bioteknikområdet är en av konstant förändring. Den snabba tillväxten och utvecklingen av avancerad forskning är beroende av forskarnas innovation och kreativitet och deras förmåga att se potentialen i en grundläggande molekylär teknik och tillämpa den på nya processer. Tillkomsten av PCR öppnade många dörrar inom genetisk forskning, inklusive ett medel för DNA-analys och identifiering av olika gener baserat på deras DNA-sekvenser.

DNA-sekvensering är också beroende av vår förmåga att använda gelelektrofores för att separera DNA-strängar som varierar i storlek med så lite som ett baspar.

DNA-sekvensering

I slutet av 1970-talet uppfanns två DNA-sekvenseringstekniker för längre DNA-molekyler. Dessa var metoden Sanger (eller dideoxy) och metoden Maxam-Gilbert (kemisk klyvning). Maxam-Gilbert-metoden är baserad på nukleotidspecifik klyvning med kemikalier och används bäst för att sekvensera oligonukleotider (korta nukleotidpolymerer, vanligtvis mindre än 50 baspar i längd). Sanger-metoden används vanligare eftersom det har visat sig vara tekniskt lättare att applicera, och med tillkomsten av PCR och automatisering av tekniken, appliceras lätt på långa DNA-strängar inklusive några hela gener. Denna teknik är baserad på kedjestoppning av dideoxynukleotider under PCR-förlängningsreaktioner.

Sångermetod

I Sanger-metoden används DNA-strängen som ska analyseras som en mall och DNA-polymeras används i en PCR-reaktion för att alstra gratis strängar med användning av primers.

Fyra olika PCR-reaktionsblandningar framställs, vardera innehållande en viss procent av dideoxynukleosidtrifosfat (ddNTP) -analoger till en av de fyra nukleotiderna (ATP, CTP, GTP eller TTP). Syntes av den nya DNA-strängen fortsätter tills en av dessa analoger inkorporeras, vid vilken tid strängen förkortas i förtid.

Varje PCR-reaktion kommer slutligen att innehålla en blandning av olika längder av DNA-strängar, vilket slutar med nukleotiden som var dideoxi-märkt för den reaktionen. Gelelektrofores användes sedan för att separera strängarna i de fyra reaktionerna, i fyra separata banor och bestämma sekvensen av den ursprungliga mallen baserat på vilka längder av strängar som slutar med vilken nukleotid.

I den automatiska Sanger-reaktionen används primers som är märkta med fyra olika färgade fluorescerande märken. PCR-reaktioner, i närvaro av de olika dideoxy-nukleotiderna, utförs som beskrivits ovan. Därefter kombineras de fyra reaktionsblandningarna sedan och appliceras på en enkel lane i en gel. Färgen på varje fragment detekteras med hjälp av en laserstråle och informationen samlas in av en dator som genererar kromatogram som visar toppar för varje färg, från vilken mall-DNA-sekvensen kan bestämmas.

Vanligtvis är den automatiserade sekvenseringsmetoden endast exakt för sekvenser upp till maximalt ca 700-800 baspar i längd. Det är emellertid möjligt att erhålla fullständiga sekvenser av större gener och i själva verket hela genomer, med användning av stegvisa metoder såsom Primer Walking och Shotgun-sekvensering.

I Primer Walking sekvenseras en bearbetbar del av en större gen med användning av Sanger-metoden. Nya primers genereras från ett tillförlitligt segment av sekvensen och användes för att fortsätta sekvensering av delen av genen, som var utanför området för de ursprungliga reaktionerna.

Haglighetssekvensering medför slumpmässigt att skära DNA-segmentet av intresse i mer lämpliga (hanterbara) storleksfragment, sekvensering av varje fragment och arrangering av bitarna baserade på överlappande sekvenser. Denna teknik har underlättats genom tillämpning av datorprogram för att arrangera de överlappande bitarna.